32通道移液工作站在禽流感检测血凝抑制实验（HI实验)中的应用

        方 案 摘 要    

禽流感病毒（AIV）属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些甲型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。

在禽流感防控领域，血凝抑制实验（HI实验）作为血清学检测的金标准，其检测效率与准确性直接关系到疫情监测和疫苗评价的质量。传统手工操作面临通量低、重复性差等瓶颈，32通道移液工作站含4个并排的8通道移液头，是传统的8道移液枪的4倍，通过高通量的自动化移液技术重塑实验室工作流程，显著提升HI实验的标准化水平与检测能力。

          方 案 详 情      

   一.实验原理          

 ‌HI实验又叫血凝抑制实验。‌是通过利用特异性抗体抑制血凝现象，从而检测血清中的抗体滴度的一种方法。

二.实验准备             

1、设备和材料

① fluidot 32道移液工作站FDT-8*4-16或FDT-8*4-28

② 96孔血凝板 ICF-PS-96V-S

③血凝/血凝抑制实验分析仪

2、试剂和材料

① 阿氏(Alsevers)液。

② 21%(体积分数)鸡红细胞悬液。

③ pH 7.2、0.01 mol/L PBS。

④ AIV HA 分型参考抗原、参考阳性血清、阴性血清。

  三.实验步骤          

1、工作站自动取32个吸头，在 96孔V形微量反应板中，1-11列加25μL PBS，12列加50μL PBS

2、鸡血清不需要处理，可直接进行检测；若为水禽或奶牛等血清，建议将血清进行预处理。取32个吸头，第1列加 25μL血清，自动吹吸混匀。

3、与PBS充分混匀后吸25μL于第2行；若血清经过预处理，第1列不加PBS，直接加处理过的血清25μL，第2列加入处理过的血清25μL，与 PBS充分混匀后吸25 μL于第3孔。依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL，弃去，第 11 孔作为抗原对照。单独设立两行对照，一行加阳性血清，一行加阴性血清。

4、取32个吸头，第1列~第11列等量加入25μL 4HAU抗原，在室温(约 20 ℃)下静置 30 min或4 ℃ 60 min。

5、取32个吸头，每孔加入25 μL, 1%(体积分数)鸡红细胞悬液，自动混匀后弃去吸头，在室温(约 20 ℃)下静置 40 min 或4℃ 60 min，空白对照孔(12 孔)红细胞呈显著纽扣状时判定结果。

   四、结果判定   

1、 当抗原/病毒对照孔(第 11孔)完全凝集，且阴性对照血清抗体效价不高于 1:4，阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过1个滴度时，试验结果方可成立。以完全抑制4HAU 抗原/病毒的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。

2、 用于检测抗原/病毒时，能够被某亚型 AIV参考阳性血清特异性抑制，H抗体效价≥1:16时判定为该亚型 AIV 阳性；1:2≤H抗体效价<1:8判为该亚型 AIV 疑似，应结合其他病毒检测方法进行鉴定；无HI抗体效价判为该亚型AI 阴性。

3、 用于检测抗体/血清时，免疫禽 H抗体效价≤1:8判为阴性，HI抗体效价>1:16判为阳性。

 4、 若血清进行了预处理，当抗原/病毒对照孔(第 11孔)完全凝集，且阴性对照血清抗体效价<1:10，阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过1个滴度时，试验结果方可成立。以完全抑制4hau抗原>1:20时判定为阳性;

血清抗体效价<1:10判为阴性；用于检测免疫水禽抗体/血清时，血清H抗体效价<1:10判为阴性，血清hi抗体效价>1:10判为阳性；用于未免疫水禽或哺乳动物感染病毒诊断依据时，HI抗体效价≥1:20判为阳性。