Pipetty电动移液器在尼帕病毒检测（实时荧光定量RT-PCR)中的应用

摘要：根据国家疾控中心相关的尼帕病毒实验室检测技术方案，旨在提供Pipetty电动移液器在尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR检测中的具体应用，结合核酸提取、RT-PCR反应体系配制、扩增检测等核心实验环节，发挥其精准微量移液、高效操作、防交叉污染的优势，规范实验操作步骤，保障尼帕病毒核酸检测结果的准确性、重复性和可靠性，为实验室开展尼帕病毒快速筛查与确诊提供标准化技术支撑。

方案详情：

一、实验原理

尼帕病毒属于单股负链RNA病毒，实时荧光定量RT-PCR（Realtime RT-PCR）技术是检测该病毒的核心方法，其原理是先通过反转录酶将病毒RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，利用尼帕病毒特异性上游引物、下游引物与荧光探针，在Taq酶作用下进行PCR扩增。扩增过程中，荧光探针与目的片段特异性结合，随着扩增循环的进行，荧光信号不断累积，通过仪器实时监测荧光强度，可实现对尼帕病毒核酸的定性判断和定量分析。

二、‌实验准备

1、设配和材料

① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；

② 核酸提取仪；

③ PCR扩增仪；

④ 生物安全柜；

⑤ 水浴锅；

⑥ 冰箱和冰柜；

⑦ 离心机。

2、试剂和材料

① 上游引物TCA-GCA-GGA-AGG-CAA-GAG-AGT-AA；

下游引物CCC-CTT-CAT-CGA-TAT-CTT-GAT-CA；

荧光探针FAM-CCT-CCA-ATG-AGC-ACA-CCT-CCT-GCA-G-TAMRA；

② RT-PCR试剂盒；

③ 阴性对照；

④ 阳性对照；

⑤ 无核酶水；

⑥ RNA提取试剂。

三、实验步骤

1、将待测样本（如血液、脑脊液、尿液等）在生物安全柜中进行预处理。

2、反应条件根据实验室具体使用的商业化 Realtime RT-PCR试剂盒为准，以QIAGEN公司OneStepRT-PCR试剂盒为例。核酸扩增检测的反应体系如下：

3、反应体系

注：每次检测均需配制阳性对照和阴性对照作为实验室检测质控。

4、使用Pipetty电动移液器根据预设的荧光PCR反应体系表，设置单次分液模式；先计算所需总孔数，将除待测样本之外的所有试剂按对应体积计算后，额外增加10%的试剂体积，精准移取至同一离心管中，开启移液器混匀模式，将试剂自动混匀。

5、将Pipetty电动移液器切换至连续分液模式，根据单孔反应体系体积，精准吸取混合好的试剂，分别加入到96孔PCR板的对应孔中。再用移液器精准吸取对应体积的待测样本，加入到对应孔中，将96孔板放入高速离心机，离心。

6、反应程序设置（按照实时荧光定量PCR扩增仪说明书操作）：

 反转录阶段：50℃，30分钟；95℃，15分钟（无循环，完成反转录及酶激活）；

扩增阶段：95℃，30秒（变性）；55℃，30秒（退火）；72℃，60秒（延伸），读取荧光信号，共40个循环；

扩增结束后，仪器自动生成扩增曲线和Ct值，用于结果判定。

四、结果判定

1、尼帕病毒核酸实时荧光定量RT-PCR 方法实验室检测有效性判读条件:

(1)阳性对照Ct值<35;

(2)阴性对照无Ct值(无扩增曲线)。同时满足上述两个条件，实验室检测结果有效;上述任一条件不满足，实验室检测结果无效。

2、待测标本核酸实验室检测结果判读:

(1)待测标本Ct值<35，标本为尼帕病毒阳性;

(2)待测标本Ct值>38，标本为尼帕病毒阴性;

(3)待测标本Ct值≥35且Ct值≤38，标本需要再次提取核酸进行复核检测。